诚心求助关于细胞骨架蛋白提取的方法

1. 诚心求助关于细胞骨架蛋白提取的方法

细胞骨架蛋白提取的方法
（一）水溶液提取法 

稀盐和缓冲
系统
的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 

1、pH值 

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 

2、盐浓度 

稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 

（二）有机溶剂提取法 

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

2. 求助：怎么提取细胞上清液中的蛋白

怎么提取细胞上清液中的蛋白 western blot中蛋白样品调节浓度有很多方法 先检测出各个蛋白样品的浓度，根据体积通过不同单位的Loading buffer将样品稀释成不同的体积，即可以保证各个蛋白样品浓度一致 或者在样品裂解的时候，用裂解液或者PBS去稀释蛋白样品，达到调节浓度的。细胞比较简单，只有细胞膜，抽提过程中，很容易破坏细胞膜，从而得到蛋白，相应蛋白中受到其他物质干扰也比较少，样品较为干净。但是用组织的时候，组织由细胞组成，但是从组织中抽提丹巴就要复杂，做组织匀浆以后，再分离组织碎片和蛋白，但是分离过程可能没有那么好，组织中含有的各种杂质，杂蛋白就比细胞中要多，要复杂。因此选择适当的方法提取组织蛋白，对于后续的Western来说还是非常重要的，这也是为什么细胞的蛋白做WB挺好，但是换到组织，可能有些条件就需要进一步优化了。

3. 求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol

我个人经验，也以六孔板为例：
1、移除旧培养液
2、每孔加PBS1ml，漂洗1到2次
3、每孔加蛋白裂解液100ul（蛋白裂解液不易加多，多了会稀释蛋白浓度）
4、然后用细胞刮棒来回刮除细胞，用枪头吸出液体至干净的EP管（操作最好在冰上，尽量吸干净）
5、短暂振荡一下，置冰静置15到30分钟
6、离心：12000转，20min。离心结束后你会看到管底有沉淀
7、将上清液移至新的EP管，注意不要碰到沉淀，取10ul留作后来蛋白定量，剩下的记下转移量
8、我们实验室用5X上样缓冲液按1:4的体积加入，比如你上面的转移量是80微升，那么就加入5X上样缓冲液20微升。
9、短暂振荡，离心
10、煮蛋白，就是沸水5分钟
11、最后-80度保存就可以了

我自己就这样，呵呵，其实很简单

4. 组织总蛋白提取原理

关键词：脑组织 目的：熟练进行脑组织蛋白质的提取 背景知识：无 原理：无 具体内容： 脑组织总蛋白质提取方法 1．将低温保存的样本称重。 2．加入裂解液。样本与组织比例=1：3~3.5 w/v，一般为150~170mg：500μl。加入50×Cocktail蛋白酶抑制剂。可利用振荡器、加样器，将组织块吹散。 3．液氮中冻融3~4次。1min/time，室温中自然融化。 4．超声破碎。将含裂解液的EP tube埋入冰中，超声3~4sec/time，强度为最大强度的3/4。间隔10几sec。至溶液透明。小心空泡效应。 5．加入Dnase I，Rnase A。10μg/μl，5μl。4℃ 30min。 6．4℃ 14000g/min 离心25~30mins。 7．提上清，分装。保存。 细胞裂解液 Tris （40mM） 24.2mg 48.4 mg 96.8mg 尿素(urea) (7M) 2.102g 4.204g 8.408g 硫脲（thiourea） (2M) 0.761g 1.522g 3.044g 4% CHAPS 0.2g 0.4g 0.8g 1%二硫苏糖醇(DTT) 0.05g 0.1g 0.2g 乙二胺四乙酸二钠 1.86mg 3.72mg 7.44mg (EDTA) (1mM) 加去离子水至 5 ml 10 ml 20 ml

5. 心肌细胞内质网蛋白GRP78怎么提取？

1. 收集的如果是组织要在液氮中研磨以后才加蛋白提取液
2. 反复冻融会降低蛋白活性
3. 定量一般要用一些reagent比如Bradford assay

这么做只能提取总蛋白，你是要纯化单独一个蛋白吗？

6. 细胞总蛋白提取 多少可以跑蛋白

你还要看你的细胞有多少，75mm2培养皿的细胞融合约90%时，我是用200μl的裂解液加磷酸酶抑制剂2μl，100mM氟化钠2μl,100mM原钒酸钠2μl，100mM PMSF2μl.冰上裂解30min，再12000g离心5min，取上清，测出来的蛋白深度一般是6.0μg/μl。
组织蛋白就要先在匀浆机匀浆后离心再取上清就行，其他的一样。

7. 紧急求助微管蛋白的提取方法

细胞微管蛋白的提取：离心收集培养液中悬浮细胞，再用预冷的PBS将培养瓶中贴壁生长的细胞及离心收集得到的细胞洗涤两次。每瓶细胞加入300μl细胞低渗裂解液冰浴裂解20min后将刮取细胞，全部转移至Eppendorf管中，14,000×g室温离心10min，收集上清液，其中含有未聚合的微管蛋白；沉淀部分用与上清等体积的裂解液充分悬浮后，冰浴5min，4℃12,000×g时离心，弃去沉淀，此部分上清中即含有原来沉淀中聚合的微管蛋白。

8. 提取的细胞总蛋白，里面有膜蛋白吗

总蛋白和膜蛋白提取方法
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膜蛋白具有多种功能，在细胞识别、细胞信号转导、运输等有着中着重要的角色，因此也是极佳的药物靶点。抽提膜蛋白主要是进行蛋白组分析：常用的实验是非变性胶电泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot 等。本文叙述了总蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。 

一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法) 

1.  自配裂解液(pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA , 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1 μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50 ml 裂解液/1 g湿菌体。 

2.  将40 ml 菌液在12000 g，4 ℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1 ml裂解液悬浮菌体。 

3.  超声粉碎，采用300 w，10 s超声/10 s间隔，超声20 min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
4.  1000 g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

1.  Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8 ℃下10000 g离心15 min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2.  用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1 ml Trizol加入0.3 ml无水乙醇混匀，室温放置3 min，2-8 ℃不超过2000 g离心5 min。

3.  将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1 ml Trizol加入1.5 ml异丙醇，室温放置10 min，2-8 ℃下12000 g离心10 min，弃上清。

4.  用含有0.3 M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1 ml Trizol加入2 ml洗液，室温放置20 min， 2-8 ℃下7500 g离心5 min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2 ml无水乙醇，涡旋后室温放置20 min，2-8 ℃下7500 g离心5 min，弃上清。

5.  冷冻干燥5-10 min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50 ℃温浴使其完全溶解，2-8 ℃下10000 g离心10 min去除不溶物。

6.  替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8 ℃的1% SDS溶液中透析3次，1000 g离心10 min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。

三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)

1.  配制疏水性蛋白提取液(非裂解液)：1% Triton X-114，150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，调pH值至8.0备用。

2.  菌液于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体。

3.  菌体沉淀加入1 ml冷提取液，于4 ℃条件下放置2 h，17000 g离心10 min，去除沉淀取上清。

4.  将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37 ℃条件下放置10 min使其分层。室温下1000 g离心10 min使液相和去污相充分分层。

5.  将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45 min。

6.  于4 ℃条件下17000 g离心30 min，用去离子水洗涤沉淀3次。

7.  将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。

8.  SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。